Produkte
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-opsporingstel vir 2019-nCoV
Verwagte gebruik
Hierdie stel word gebruik vir die kwalitatiewe opsporing van nuwe koronavirus (2019-nCoV) met behulp van keelmonsters, nasofaringeale monsters, bronchoalveolêre spoelvloeistof, sputum. Die opsporingsresultaat van hierdie produk is slegs vir kliniese verwysing, en dit moet nie as die enigste bewys vir kliniese diagnose en behandeling gebruik word nie. 'n Omvattende analise van die toestand word aanbeveel in kombinasie met die pasiënt se kliniese manifestasies en ander laboratoriumtoetse.
Inspeksiebeginsel
Die stel is gebaseer op eenstap-RT-PCR-tegnologie. Trouens, die 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV) ORF1ab en N gene is gekies as die amplifikasieteikenstreke. Spesifieke primers en fluorescerende probes (N-geenprobes word gemerk met FAM en ORF1ab-probes word gemerk met HEX) is ontwerp om 2019 nuwe-tipe koronavirus RNA in monsters op te spoor. Die stel bevat ook 'n endogene interne beheeropsporingstelsel (interne beheergeenprobe gemerk met CY5) om die proses van monsterversameling, RNA en PCR-amplifikasie te monitor, waardeur vals negatiewe resultate verminder word.
Hoofkomponente
| Komponente | Volume(48T/Stel） |
| RT-PCR-reaksie-oplossing | 96µl |
| nCOV-primer TaqMan-probemengsel (ORF1ab, N-geen, RNAseP-geen) | 864µl |
| Negatiewe beheer | 1500µl |
| nCOV Positiewe beheer（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Eie reagense: RNA-ekstraksie of suiweringsreagense. Negatiewe/positiewe kontrole: Die positiewe kontrole is RNA wat die teikenfragment bevat, terwyl die negatiewe kontrole nukleïensuurvrye water is. Tydens gebruik moet hulle aan die ekstraksie deelneem en as aansteeklik beskou word. Hulle moet hanteer en weggedoen word in ooreenstemming met relevante regulasies.
Die interne verwysingsgeen is die menslike RnaseP-geen.
Bergingstoestande en vervaldatum
-20±5℃, vermy herhaalde vries en ontdooiing meer as 5 keer, geldig vir 6 maande.
Toepaslike instrument
Met FAM / HEX / CY5 en ander multikanaal fluorescerende PCR-instrument.
Vereistes vir monsters
1. Toepaslike monstertipes: keeldeppers, nasofaringeale deppers, bronchoalveolêre spoelvloeistof, sputum.
2. Monsterversameling (aseptiese tegniek)
Faringeale depper: Vee die mangels en die posterior faringeale wand met twee deppers gelyktydig af, en dompel dan die depperkop in 'n proefbuis wat die monsteroplossing bevat.
Sputum: Nadat die pasiënt 'n diep hoes het, versamel die gehoesde sputum in 'n skroefdop-proefbuis wat die monsteroplossing bevat; bronchoalveolêre spoelvloeistof: Monsterneming deur mediese professionele persone. 3. Berging en vervoer van monsters
Monsters vir virusisolasie en RNA-toetsing moet so gou as moontlik getoets word. Monsters wat binne 24 uur opgespoor kan word, kan by 4 ℃ gestoor word; dié wat nie binne 24 uur opgespoor kan word nie, kan by 4 ℃ gestoor word.
ure moet gestoor word by -70℃ of laer (indien daar geen bergingstoestand van -70℃ is nie, moet hulle
tydelik gestoor by -20℃ yskas). Monsters moet herhaaldelik gevries en ontdooi word tydens vervoer. Monsters moet so gou as moontlik na versameling na die laboratorium gestuur word. Indien monsters oor lang afstande vervoer moet word, word droëysberging aanbeveel.
Toetsmetodes
1 Monsterverwerking en RNA-ekstraksie (monsterverwerkingsarea)
Dit word aanbeveel om 200 μl vloeibare monster vir RNA-ekstraksie te neem. Vir verwante ekstraksiestappe, verwys na die instruksies van kommersiële RNA-ekstraksiestelle. Beide die negatiewe en negatiewe
kontroles in hierdie stel was betrokke by die ekstraksie.
2 PCR-reagensvoorbereiding (reagensvoorbereidingsarea)
2.1 Verwyder alle komponente uit die stel en ontdooi en meng by kamertemperatuur. Sentrifugeer teen 8 000 rpm vir 'n paar sekondes voor gebruik; bereken die benodigde hoeveelheid reagense, en die reaksiestelsel word voorberei soos in die volgende tabel getoon:
| Komponente | N porsie (25µl stelsel) |
| nCOV primer TaqMan probemengsel | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaksie-oplossing | 2 µl × N |
| *N = aantal monsters getoets + 1 (negatiewe kontrole) + 1 (nCOVpositiewe kontrole) | |
2.2 Nadat die komponente deeglik gemeng is, sentrifugeer vir 'n kort tydjie sodat al die vloeistof op die buiswand na die bodem van die buis val, en plaas dan die 20 µl-amplifikasiestelsel in die PCR-buis.
3 Monsterneming (monstervoorbereidingsarea)
Voeg 5 μl van die negatiewe en positiewe kontroles by na ekstraksie. Die RNA van die monster wat getoets moet word, word by die PCR-reaksiebuis gevoeg.
Maak die buis styf toe en sentrifugeer teen 8 000 rpm vir 'n paar sekondes voordat dit na die versterkingsdeteksiearea oorgeplaas word.
4 PCR-amplifikasie (versterkte deteksie-area)
4.1 Plaas die reaksiebuis in die monstersel van die instrument en stel die parameters soos volg in:
| verhoog | Siklus nommer | Temperatuur(°C) | Tyd | versamelingwerf |
| Omgekeerdtranskripsie | 1 | 42 | 10 min | - |
| Voor-denaturasien | 1 | 95 | 1 minuut | - |
| Siklus | 45 | 95 | 15's | - |
| 60 | 30's | data-insameling |
Instrumentdeteksiekanaalkeuse: Kies die FAM, HEX, CY5-kanaal vir die fluoresensiesein. Vir verwysingsfluoresensie GEEN, kies asseblief nie ROX nie.
5 Resultaatanalise (Verwys asseblief na die eksperimentele instruksies van elke instrument vir instelling)
Na die reaksie, stoor die resultate. Na analise, pas die beginwaarde, eindwaarde en drempelwaarde van die basislyn aan volgens die beeld (die gebruiker kan aanpas volgens die werklike situasie, die beginwaarde kan gestel word op 3~15, die eindwaarde kan gestel word op 5~20, aanpassing) in die logaritmiese grafiek. By die drempel van die venster is die drempellyn in die logaritmiese fase, en die versterkingskromme van die negatiewe kontrole is 'n reguit lyn of onder die drempellyn).
6 Kwaliteitskontrole (’n Prosedurele kontrole is in die toets ingesluit) Negatiewe kontrole: Geen duidelike versterkingskurwe vir FAM-, HEX-, CY5-deteksiekanale nie
COV positiewe beheer: duidelike versterkingskurwe van FAM- en HEX-deteksiekanale, Ct-waarde ≤32, maar geen versterkingskurwe van CY5-kanaal nie;
Bogenoemde vereistes moet gelyktydig in dieselfde eksperiment nagekom word; andersins is die eksperiment ongeldig en moet dit herhaal word.
7 Bepaling van resultate.
7.1 Indien daar geen versterkingskurwe of Ct-waarde > 40 in die FAM- en HEX-kanale van die toetsmonster is nie, en daar 'n versterkingskurwe in die CY5-kanaal is, kan daar beoordeel word dat daar geen 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV) RNA in die monster is nie;
.2 Indien die toetsmonster duidelike versterkingskrommes in die FAM- en HEX-kanale het, en die Ct-waarde ≤40 is, kan daar beoordeel word dat die monster positief is vir die 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV).
7.3 Indien die toetsmonster slegs 'n duidelike versterkingskurwe in een kanaal van FAM of HEX het, en die Ct-waarde ≤40 is, en daar geen versterkingskurwe in die ander kanaal is nie, moet die resultate hertoets word. Indien die hertoetsresultate konsekwent is, kan die monster as positief vir die nuwe beoordeel word.
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Indien die hertoetsresultaat negatief is, kan daar beoordeel word dat die monster negatief is vir die nuwe koronavirus van 2019 (2019-nCoV).
Positiewe oordeelswaarde
Die ROC-krommemetode word gebruik om die verwysings-CT-waarde van die stel te bepaal en die interne beheerverwysingswaarde is 40.
Interpretasie van toetsresultate
1. Elke eksperiment moet getoets word vir negatiewe en positiewe kontroles. Toetsresultate kan slegs bepaal word wanneer kontroles aan kwaliteitsbeheervereistes voldoen.
2. Wanneer die FAM- en HEX-opsporingskanale positief is, kan die resultaat van die CY5-kanaal (interne beheerkanaal) negatief wees as gevolg van stelselkompetisie.
3. Wanneer die interne beheerresultaat negatief is, en die proefbuis se FAM- en HEX-deteksiekanale ook negatief is, beteken dit dat die stelsel gedeaktiveer is of die werking verkeerd is, en die toets is ongeldig. Daarom moet die monsters weer getoets word.
