Produkte
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-opsporingstel vir 2019-nCoV
Verwagte gebruik
Hierdie stel word gebruik vir die kwalitatiewe opsporing van nuwe koronavirus (2019-nCoV) met behulp van keeldeppers, nasofaryngeale deppers, brongoalveolêre spoelvloeistof, sputum. Die opsporingsresultaat van hierdie produk is slegs vir kliniese verwysing, en dit moet nie as die enigste gebruik word nie bewyse vir kliniese diagnose en behandeling. 'n Omvattende ontleding van die toestand word aanbeveel in kombinasie met die pasiënt se kliniese manifestasies en ander laboratoriumtoetse.
Inspeksie beginsel
Die kit is gebaseer op eenstap RT-PCR-tegnologie.Trouens, die 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV) ORF1ab- en N-gene is gekies as die amplifikasie-teikenstreke.Spesifieke primers en fluoresserende probes (N geen probes is gemerk met FAM en ORF1ab probes is gemerk met HEX) is ontwerp om 2019 nuwe-tipe koronavirus RNA in monsters op te spoor.Die stel bevat ook 'n endogene interne beheer opsporingstelsel (interne beheer geen-probe gemerk met CY5) om die proses van monsterinsameling, RNA en PCR amplifikasie te monitor, en sodoende vals negatiewe resultate te verminder.
Hoofkomponente
| Komponente | Volume(48T/stel） |
| RT-PCR reaksie oplossing | 96 µl |
| nCOV-primer TaqMan-probemengsel (ORF1ab, N-geen, RNAseP-geen) | 864 µl |
| Negatiewe beheer | 1500 µl |
| nCOV Positiewe beheer（l ORF1ab N Gene） | 1500 µl |
Eie reagense: RNA-ekstraksie- of suiweringsreagense.Negatiewe/positiewe kontrole: Die positiewe kontrole is RNA wat die teikenfragment bevat, terwyl die negatiewe kontrole nukleïensuurvrye water is.Tydens gebruik moet hulle aan die ekstraksie deelneem en moet hulle as aansteeklik beskou word.Hulle moet in ooreenstemming met toepaslike regulasies hanteer en weggedoen word.
Die interne verwysingsgeen is die menslike RNAseP-geen.
Bergingsvoorwaardes en vervaldatum
-20±5℃,vermy herhaalde vries en ontdooiing meer as 5 keer, geldig vir 6 maande.
Toepaslike instrument
Met FAM / HEX / CY5 en ander multi-kanaal fluoresserende PCR instrument.
Monster vereistes
1. Toepaslike monstertipes: keeldeppers, nasofaryngeale deppers, brongoalveolêre spoelvloeistof, sputum.
2. Monsterversameling (aseptiese tegniek)
Faringeale depper: Vee die mangels en posterior faringeale wand gelyktydig met twee deppers af, en dompel dan die depperkop in 'n proefbuis wat die monsteroplossing bevat
Sputum: Nadat die pasiënt 'n diep hoes het, versamel die sputum wat gehoes is in 'n skroefdop-proefbuis wat die monsteroplossing bevat;brongoalveolêre spoelvloeistof: Monsterneming deur mediese spesialiste.3.Stoor en vervoer van monsters
Monsters vir virusisolasie en RNA-toetsing moet so gou as moontlik getoets word.Monsters wat binne 24 uur opgespoor kan word, kan by 4℃ gestoor word;dié wat nie binne 24 opgespoor kan word nie
ure moet by -70 ℃ of onder gestoor word (as daar geen bergingstoestand van -70 ℃ is nie, moet hulle
tydelik gestoor by -20℃ yskas).Monsters moet herhaalde vries en ontdooiing tydens vervoer vermy.Monsters moet so gou as moontlik na die versameling na die laboratorium gestuur word.Indien monsters oor lang afstande vervoer moet word, word droëysberging aanbeveel.
Toetsmetodes
1 Monsterverwerking en RNA-ekstraksie (monsterverwerkingsarea)
Dit word aanbeveel om 200μl vloeistofmonster te neem vir RNA-ekstraksie.Vir verwante ekstraksiestappe, verwys na die instruksies van kommersiële RNA-ekstraksiestelle.Beide die negatiewe en negatiewe
kontroles in hierdie stel was betrokke by die onttrekking.
2 PCR reagens voorbereiding (reagens voorbereiding area)
2.1 Verwyder alle komponente uit die kit en ontdooi en meng by kamertemperatuur.Sentrifugeer by 8 000 rpm vir 'n paar sekondes voor gebruik;bereken die vereiste hoeveelheid reagense, en die reaksiestelsel word voorberei soos in die volgende tabel getoon:
| Komponente | N porsie (25 µl stelsel) |
| nCOV primer TaqMan probemengsel | 18 µl × N |
| RT-PCR reaksie oplossing | 2 µl × N |
| *N = aantal monsters getoets + 1 (negatiewe kontrole) + 1 (nCOVpositiewe beheer) | |
2.2 Nadat die komponente deeglik gemeng is, sentrifugeer vir 'n kort tydjie om al die vloeistof op die buiswand na die onderkant van die buis te laat val, en dan die 20 µl amplifikasiestelsel in die PKR-buis in 'n portie.
3 Monsterneming (monstervoorbereidingsarea)
Voeg 5μl van die negatiewe en positiewe kontroles by na ekstraksie.Die RNA van die monster wat getoets moet word, word by die PCR-reaksiebuis gevoeg.
Maak die buis styf toe en sentrifugeer vir 'n paar sekondes teen 8 000 rpm voordat dit na die amplifikasie-opsporingsarea oorgeplaas word.
4 PCR-amplifikasie (versterkte opsporingsarea)
4.1 Plaas die reaksiebuis in die monstersel van die instrument, en stel die parameters soos volg in:
| stadium | Siklus nommer | Temperatuur(°C) | Tyd | versamelingwerf |
| Omgekeerdetranskripsie | 1 | 42 | 10min | - |
| Pre-denaturasien | 1 | 95 | 1 min | - |
| Siklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30's | data-insameling |
Instrumentopsporingskanaalkeuse: Kies die FAM、HEX、CY5-kanaal vir die fluoressensiesein.Vir verwysing fluoresserend GEEN, moet asseblief nie ROX kies nie.
5 Resultaatontleding (verwys asseblief na die eksperimentele instruksies van elke instrument vir instelling)
Stoor die resultate na die reaksie.Pas na ontleding die beginwaarde, eindwaarde en drempelwaarde van die basislyn aan volgens die beeld (die gebruiker kan aanpas volgens die werklike situasie, die beginwaarde kan op 3 ~ 15 gestel word, die eindwaarde kan ingestel word op 5~20, aanpassing) in die logaritmiese grafiek By die drumpel van die venster is die drempellyn in die logaritmiese fase, en die versterkingskromme van die negatiewe beheer is 'n reguit lyn of onder die drumpellyn).
6 Quauty-kontrole ('n Proseduele kontrole is by die toets ingesluit) Negatiewe beheer: Geen ooglopende versterkingskromme vir FAM-, HEX-, CY5-opsporingskanale nie
COV positiewe beheer: duidelike versterkingskurwe van FAM- en HEX-opsporingskanale, Ct-waarde≤32, maar geen versterkingskurwe van CY5-kanaal nie;
Bogenoemde vereistes moet gelyktydig in dieselfde eksperiment nagekom word;anders is die eksperiment ongeldig en moet dit herhaal word.
7 Bepaling van resultate.
7.1 As daar geen amplifikasiekromme of Ct-waarde> 40 in die FAM- en HEX-kanale van die toetsmonster is nie, en daar is 'n versterkingskromme in die CY5-kanaal, kan daar geoordeel word dat daar geen 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV) is nie. RNA in die monster;
.2 As die toetsmonster duidelike versterkingskrommes in die FAM- en HEX-kanale het, en die Ct-waarde is ≤40, kan daar geoordeel word dat die monster positief is vir die 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV).
7.3 As die toetsmonster 'n duidelike versterkingskromme slegs in een kanaal van FAM of HEX het, en die Ct-waarde is ≤40, en daar is geen versterkingskromme in die ander kanaal nie, moet die resultate hertoets word.As die hertoetsresultate konsekwent is, kan die monster as positief vir die nuwe beoordeel word
koronavirus 2019 (2019-nCoV).As die hertoetsuitslag negatief is, kan daar geoordeel word dat die monster negatief is vir 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV).
Positiewe oordeelswaarde
Die ROC-krommemetode word gebruik om die verwysings-CT-waarde van die stel te bepaal en die interne beheerverwysingswaarde is 40.
Interpretasie van toetsresultate
1.Elke eksperiment moet vir negatiewe en positiewe kontroles getoets word.Toetsresultate kan slegs bepaal word wanneer kontroles voldoen aan gehaltebeheervereistes
2.Wanneer die FAM- en HEX-opsporingskanale positief is, kan die resultaat van die CY5-kanaal (interne beheerkanaal) negatief wees as gevolg van stelselmededinging.
3.Wanneer die interne beheerresultaat negatief is, as die proefbuis se FAM- en HEX-bespeuringskanale ook negatief is, beteken dit dat die stelsel gedeaktiveer is of die werking verkeerd is, t die toets ongeldig is.Daarom moet die monsters weer getoets word.
